Millised on võõra DNA bakteritesse kandmise erinevad viisid?

Võõr-DNA ülekandmiseks peremeesrakku on rakendatud erinevaid meetodeid. Geenisiirdeid on kahes laias kategoorias, mis toimuvad looduslikult või kunstlikult inimese sekkumisega.

Geeni horisontaalne ülekandmine : seda võib määratleda kui materjali ülekandmist ühest rakust teise, välja arvatud vanema tütarrakku.

Geeni vertikaalne ülekandmine: selles toimub geeniülekanne emaraku vahel tütarrakku.

HGT [1] hõlmab muundamist, transfektsiooni ja konjugatsiooni.

Transformatsioon : oleme Griffithi eksperimendi ja tema ümberkujundava põhimõttega üsna tuttavad. Seda võib määratleda kui sissevõtmist, kui alasti DNA ja selle integreerimine bakterisüsteemi. Muunemist on looduslikult täheldatud taimedes, loomades ja bakterites. Transformatsiooni saab teha kunstlikult, rakendades spetsiifilisi meetodeid nagu elektroporatsioon, ballistiline meetod, keemilised meetodid jne.

Transfektsioon [2] : see sarnaneb transformatsiooniga. Eukarüootsete rakkude puhul kasutatakse vähktõvega transformatsioonisõna ja seega võetakse kasutusele transfektsioonisõna. Transfektsiooniprotsess hõlmab viirust kui keskkonda geneetilise materjali ülekandmiseks eukarüootsesse süsteemi.

Konjugatsioon : see on bakterites ja teistes prokarüootides looduslikult esinev protsess, mis hõlbustab seksuaalset paljunemist. Konjugatsioon toimub konjugatsioonisilla moodustamisega, mis võimaldab doonorrakul (isasel) geneetilist materjali retsipientrakku (naissoost) üle kanda. Konjugeerumissilla moodustavad kahe bakteri pilid (nn soopilid). Märkus: bakteriofaagid nagu M13 kasutavad neid pilisid geneetilise materjali edastamiseks otse bakterirakku.

Transformatsioonimeetodid, mida geenitehnoloogid ja biotehnoloogid kasutavad rakkude muundamiseks, jagunevad laias laastus kahte kategooriasse: füüsikalised ja keemilised meetodid.

1) Keemilised meetodid:

Töötlemine CaCl2-ga: CaCl2 destabiliseerib rakumembraani. See seondub DNA-ga ja katab fosfaadi negatiivse laengu. Seega saab DNA hõlpsalt rakku siseneda läbi lipiidide kaksikkihi. CaCl2 põhjustab DNA sadestumist lipiidmembraani välisfaasile. Kuumašoki (42 ° C) allutamine proovile suurendab transformantide saagist.

PEG-ravi: taimerakkude jaoks kasutame CaCl2 asemel PEG-i. PEG on 4000 Da molekuli ja see destabiliseerib membraani ja moodustab DNA-ga kompleksi. Seejärel transporditakse DNA kergesti rakku.

Muud keemilised meetodid hõlmavad DEAE dekstraanide, liposoomide, nanokandjate jms kasutamist.

2) Füüsikalised meetodid:

Elektroporatsioon: see hõlmab elektriliste impulsside kasutamist ajutiste pooride tekitamiseks membraanis. Väikesi plasmiide ja DNA-d saab hõlpsasti ühendada keemiliste meetodite abil, kuid suurte DNA-molekulide jaoks peame kasutama füüsikalisi meetodeid. Elektroporatsiooni jaoks peaks kontsentratsioon olema siiski kõrge. Taimerakkude korral ümbritseb rakk polüsahhariidide ja muude biomolekulide kihte nagu hemitselluloos, tselluloos, pektiin jne. Seega töödeldakse raku rakuseina eemaldamiseks ja raku muundamiseks ensüümidega nagu hemitselluloos ja tselluloos. protoplast. Seega saab membraanis poorid hõlpsasti moodustuda ja DNA-d saab elektroporatsiooni abil rakku viia.

http://www.scientzbio.com/s/

Biolistlik meetod [4] : seda nimetatakse ka osakeste pommitamise meetodiks, osakeste püssi meetodiks või lihtsalt geenipüstoliks. Seade koosneb mikrokandjatest, mis koosnevad rasketest metallidest, nagu Au, Ag, W jne. Püstol koosneb ka rebendkettast, mikrokandjatega (DNA-ga koormatud) plaadist, tõkkeplaadist ja lõpuks raku hoideplaadist. . Püstoli tulistamisel survestatakse gaas püstolisse, mis põhjustab purunemisketta purunemise. Mikrokandjaga (koos DNA-ga) plaat liigub peatusplaadi poole. Seejärel liiguks mikrokandja ja siseneks lahtrisse. Seega kantakse DNA otse rakku. Geenipüstoli kasutamisel on siiski mõned piirangud. On olemas võimalus sisestada mitu osakest ja koguneda sellesse, mis võib põhjustada geeni üleekspressiooni või geeni vaigistamist.

http://www.scientzbio.com/gene-transduction-device/

Mikrosüstid : Nende abil süstitakse DNA molekulid otse transformeeritava raku tuuma väga peene pipeti abil. Seda kasutatakse taime- ja loomsete rakkude jaoks.

Märkus. Kui andmed on ebaolulised, oleksin tänulik teie paranduste ja ettepanekute eest.

Viide ja täiendavad lugemised

Brown, TA, 2016. Geenide kloonimine ja DNA analüüs: sissejuhatus. John Wiley ja pojad.

Wolff, JA, Malone, RW, Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A. ja Felgner, PL, 1990. Otsene geeniülekanne hiire lihasesse in vivo. Science, 247 (4949 Pt 1), lk.1465-1468.

Lorenz, MG ja Wackernagel, W., 1994. Bakterite geeniülekanne keskkonnas loodusliku geneetilise muundamise teel. Mikrobioloogilised ülevaated, 58 (3), lk 563–602.

Lurquin, PF, 1997. Geeniülekanne elektroporatiidi abil